همسانه سازی و انتقال ژن tpa به گیاه توتون و آنالیز گیاهان تراریخت

بکارگیری زیست مولکولی و زیست فناوری گیاهی نشان داده است که می توان بسیاری از داروها را در حجم انبوه و به قیمت بسیار ارزان در گیاهان تولید نمود. جذابیت سیستم های گیاهی به دلیل مزایایی همچون ایمنی بالا، هزینه پائین، تغییرات پس از ترجمه و حجم بالای تولید است که نسبت به سیستم های کلاسیک (مثل باکتری ها، مخمرها و سلولهای جانوری) دارند. پروتئین داروئی (tissue plasminogen activator) tpa بطور اختصاصی و نسبتا قوی به لخته های خونی متصل شده و ترجیحا پلاسمینوژن به دام افتاده در داخل لخته ها را فعال و لخته خونی را از بین می برد. از پروتئین نوترکیب tpa به منظور درمان سکته های قلبی و مغزی استفاده می شود. در این تحقیق، به منظور بررسی امکان و نحوه بیان این پروتئین در سیستم بیانی گیاهی، cdna ژن فعال کننده پلاسمینوژن بافتی(tpa) با کمک آغازگرهای اختصاصی در ناقلt/a همسانه سازی و سپس در ناقل بیانی گیاهی pbi121 در مجاورت ژن gus همسانه سازی شد. این ژن تحت کنترل پیشبرنده camv 35s و خاتمه دهنده nos قرار گرفت. توالی افزایش دهنده kozak و ترادف رمز کننده پپتید نشانه kdel، به ترتیب به انتهاهای آمینی و کربوکسیلی ژن tpa افزوده شدند. سازه pbi-tpa ابتدا به آگروباکتریوم سوش lba4404 و سپس به ژنوم گیاهان توتون انتقال داده شد. گیاهان تراریخته روی محیط کشت انتخابگر (حاوی کانامایسینmg.l-1 100) انتخاب شدند و جوانه های تراریخت ریشه دار شده ابتدا به پرلیت و سپس به خاک منتقل شدند به منظور جلوگیری از دگرگرده افشانی غنچه قبل از باز شدن پاکت گذاری و ایزوله شدند و بذور نسل اول (t0) از آنها جمع آوری و ارزیابی پایداری ژن در نسل بعد انجام شد.. واکنش rt-pcr نیز انجام رونویسی و تولید mrna مربوطه را اثبات کرد. ژل sds-page نیز علائم اولیه و احتمالی حضور پروتئین مورد نظر(tpa) را نشان داد و از آزمون وسترن بلات جهت اطمینان از بیان پروتئین tpaاستفاده شد. آزمون زیموگرافی برای بررسی فعال بودن پروتئین تولید شده انجام شد که این آزمون هم حضور و هم فعال بودن پروتئین نوترکیب tpa را اثبات کرد. اکنون اگر بتوان این پروتئین نوترکیب را تخلیص کرد، این پروتئین داروئی توانایی حل لخته های خونی را خواهد داشت. بدیهی است با استحصال و استخراج این پروتئین نوترکیب ارزشمند علاوه بر تولید انبوه و ارزان آن، گام موثر دیگری در جهت پیشرفت داروهای نوترکیب در کشور برداشته خواهد شد.